Institut für Infektionsprävention und Krankenhaushygiene

Wir sind spezialisiert auf die Isolierung extrazellulärer Vesikel aus verschiedenen Proben, darunter Zellkulturen, Organoide, Bakterien und Körperflüssigkeiten. Unser Ansatz nutzt fortschrittliche Tangentialflussfiltrationstechniken (TFF) mit dem TFF Easy-Gerät, ergänzt durch Größenausschlusschromatographie (SEC). Mit dieser Methodik erhalten wir extrazelluläre Vesikel von höchster Reinheit und Integrität, die sich für nachfolgende analytische Zwecke oder die Charakterisierung mit einer Reihe von biochemischen und molekularbiologischen Techniken eignen.

Größe und Konzentrationsanalyse:

1. Analyse einzelner Vesikel

Dynamic Light Scattering (DLS): DLS misst die Größenverteilung von EVs, indem es analysiert, wie sie Licht streuen, während sie sich in einer Flüssigkeit bewegen. Sie liefert Informationen über die Größenverteilung von Vesikeln.

Nanoparticle Tracking Analysis (NTA): NTA verfolgt einzelne EVs durch Analyse der Brownschen Bewegung. Sie liefert Informationen über die Größenverteilung und Konzentration in bestimmten Größenbereichen.

NanoAnalyzer, nano-flow cytometry (nFCM): NanoFCM ermöglicht uns eine Multiparameteranalyse, bei der wir gleichzeitig die Partikelkonzentration, die Größenverteilung und die biochemischen Eigenschaften einzelner EVs messen. Dieser Detaillierungsgrad ist entscheidend, insbesondere bei der Untersuchung komplexer und heterogener Populationen von Nanopartikeln wie kleinen EVs.

2. Fluoreszenztechniken für die Analyse von Vesikeln:

Färbung mit Fluorophoren und Markierung von Membranen mit Farbstoffen: Wir verwenden Membranfarbstoffe, die selektiv EV-Membranen markieren, und Fluoreszenzfarbstoffe, die spezifisch an die in den EVs vorhandenen Nukleinsäuren (RNA/DNA) binden.

Fluorescence analysis: Nach der Markierung der EVs mit Membranfarbstoffen und der Färbung mit Fluorophoren zur Konzentrationsmessung analysieren wir die Proben mit einem Durchflusszytometer oder einem Fluoreszenzmikroskop. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht den Nachweis einzelner EVs in Echtzeit und die Verfolgung ihrer Interaktion und Aufnahme in lebende Zellen

Morphologie:

Transmission Electron Microscopy (TEM): Die TEM ermöglicht die direkte Visualisierung von EVs mit einer Auflösung im Nanobereich und liefert Informationen über ihre Form und Morphologie. Die zentrale Einrichtung für (TEM)-Mikroskopie am Universitätsklinikum Freiburg unter der Leitung von Dr. Martin Helmstädter bietet modernste TEM-Dienstleistungen für eine umfassende Analyse von EVs.

Protein Zusammensetzung:

1. Analyse von EV Proteinen

Bead-assisted flow cytometry:  zum Nachweis von Oberflächenproteinen auf extrazellulären Vesikeln mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die spezifisch für die Oberflächenproteine von EVs sind.

Immunocytochemistry/Immunofluorescence: umfasst die Markierung von EVs mit fluoreszierend markierten Antikörpern, die für die interessierenden Oberflächenproteine spezifisch sind.

Multiplex protein profiling assays: wird für den Nachweis von Oberflächenproteinen auf extrazellulären Vesikeln (EVs) eingesetzt und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung mehrerer Proteine in einer einzelner Probe, was einen umfassenden Ansatz zur Untersuchung der Proteinzusammensetzung von EVs bietet.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): ELISA kann zum Nachweis von Oberflächenproteinen auf EVs angepasst werden, indem EVs auf einer Festphasenoberfläche, z. B. einer Mikroplattenvertiefung, immobilisiert und mit - für die Zieloberflächenproteine spezifischen - Antikörpern,  untersucht werden. Die gebundenen Antikörper werden dann mit Enzym-konjugierten sekundären Antikörpern und einem chromogenen oder chemilumineszenten Substrat nachgewiesen.

MSD Assays - multiplex kits, Durchflusszytometrie-Kits für menschliche EV, mit denen bis zu 37 EV-Marker und 2 Kontrollen nachgewiesen werden können.

2. Ganzheitliche Protein Analyse

Western Blotting: WB wird zum Nachweis spezifischer Proteine auf der Oberfläche oder innerhalb von EVs verwendet und hilft, deren Ursprung und Transportgut zu identifizieren.

Mass Spectrometry: Mit Hilfe der Massenspektrometrie kann die Proteinzusammensetzung von EVs im Hochdurchsatzverfahren analysiert werden, was detaillierte Informationen über ihre Transportgut liefert..

Protein arrays (Sciomics Gmb) werden zur Charakterisierung der Oberflächenproteine und des Zytokingehalts von EVs verwendet.

ELISA erfasst, erkennt, charakterisiert und quantifiziert extrazelluläre Vesikel (EVs)/Exosomen in menschlichen Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen.

Lipid-Zusammensetzung:

Lipidomics: Mit Hilfe der Lipidomanalyse können die in EV-Membranen vorhandenen Lipidspezies identifiziert und quantifiziert werden, was Einblicke in ihre Lipidzusammensetzung ermöglicht.

Nucleinsäure-Analyse

RNA and DNA analysis: Techniken wie RT-qPCR und Next Generation RNA-Sequenzierung werden eingesetzt, um den RNA- und DNA-Gehalt von EVs, einschließlich microRNAs und anderer nicht-kodierender RNAs, zu analysieren.

Funktionelle Assays:

Uptake Studies: Die Aufnahme von EVs durch Zielzellen wird mit Techniken wie der konfokalen Mikroskopie untersucht, die Einblicke in ihre funktionelle Rolle bei der interzellulären Kommunikation geben können.